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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實驗步驟
點擊次數(shù):323 更新時間:2024-09-29

       實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針,當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結合時會發(fā)出信號,從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟:

1 反轉錄

使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。

該步驟將RNA模板轉化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。

反轉錄過程中使用特定引物。

2 PCR擴增:

使用特定引物對cDNA進行PCR擴增,這些引物環(huán)繞目標區(qū)域。

PCR是一個循環(huán)過程,呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。

PCR反應中包含熒光染料或探針,它們結合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。

3 熒光實時檢測:

使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。

熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例。

使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值(Ct)值,該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量,從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。


實驗步驟:

1、RNA提取:RNA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。

A、離心機4℃預冷,準備試劑:氯仿、異內醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管,戴口罩、帽子、無粉乳膠手套;

B、取出轉染建模成功24h后的細胞,吸棄培養(yǎng)液,用1×PBS清洗1次;

C、每10cm2生長的細胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細胞使其全脫落;

D、用移液槍反復吹吸裂解液直至無明顯沉淀,將裂解液全部轉移至標記好的1.5mL EP管中,室溫靜置5min;

E、往每個EP管中加0.2mL氯仿(Transzol Up體積的1/5),混勻振蕩30s,室溫靜置3min;

F、4℃條件下10000g離心15min,離心后RNA主要分布在上層水相中,體積約50%;

G、轉移上層水相于新的EP管中(約400μL,注意不要吸取到下層),每管加入0.5mL異丙醇 (Transzol Up體積的1/2),顛倒混勻,室溫孵育10min;

H、4℃下10000g離心10min后在管側和管底形成膠狀沉淀,吸棄上清,加1mL 75%乙醇吹懸沉淀;

I、4℃下7500g離心5min后棄上清,盡量吸凈,室溫晾干沉淀5min,依細胞量加入30~100μL的RNA溶解液;

K、55℃~60℃金屬浴10min,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>


2、cDNA合成:見上文

3、qPCR:按表2.6,在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應體系,反應程序為兩步法(表2.11)

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4、RT-qPCR統(tǒng)計:每個基因在不同組別中的表達在獲得3個重復的Ct值后,從ABI系統(tǒng)中拷貝原始數(shù)據(jù),挑出“Ct SD"值大于0.5的組別(需重新實驗),求出各個組的管家基因GAPDH的均值(一般相差1個Ct值以內),再依次求出實驗組和對照組與各自的GAPDH之間的Ct差值,即得到第一個ΔCt,隨后求出實驗組ΔCt和對照組ΔCt的差值,即可得到第二個ΔCt(ΔΔCt),最后使用2 -ΔΔCt法求出實驗組相對于對照組的Ct值變化倍數(shù)(實驗組2 -ΔΔCt/對照組2 -ΔΔCt=實驗組2 -ΔΔCt/2 0=實驗組2 -ΔΔCt)。將3組實驗組數(shù)據(jù)導入Graphpad 9.0,輸入對照組數(shù)據(jù)為1,使用Student's t或ANOVA進行假設檢驗,p<0.05被認為有統(tǒng)計學差異。


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