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免疫熒光技術(shù)具體操作過程陳述
點(diǎn)擊次數(shù):321 更新時(shí)間:2024-07-22

       免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。


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1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織,否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴(yán)重。

2、組織切片固定:切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min,尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片,一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。

3、血清封閉:為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的,一般10-30min.

4、一抗孵育條件:在免疫組化反應(yīng)中最重要,包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度 效guo 最好;孵育時(shí)間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37度1-2h,而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min.具體條件還要摸索。

5、二抗孵育條件:二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時(shí)間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。最后,熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

6、復(fù)染:目的是形成細(xì)胞輪廓,從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。

7、封片:為了長(zhǎng)期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時(shí)為止;當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí),則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。

8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.注意(1)單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;(3)沖洗的時(shí)間要足夠,才能徹di洗去結(jié)合的物質(zhì)。(4)PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn),當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸,結(jié)果背景一片黃(未見特異性染色),建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M.(中性及弱鹼性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強(qiáng)度則有利于分解)。

9、拍照:有條件的話最好立即拍照,若不能及時(shí)拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序;應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查;防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡;檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,熒光也明顯減弱或褪色;激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射,會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象;所以最多不得超過2~3h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí),須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后;標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚yi烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā);使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無(wú)明顯的自發(fā)熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油;電源最好裝穩(wěn)壓器,否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命,也會(huì)影響鏡檢的效果。

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