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盤點(diǎn)ELISA測定操作技術(shù)要求
點(diǎn)擊次數(shù):759 更新時間:2022-11-25

ELISA即酶聯(lián)吸附試驗(yàn),是一種常用的固相酶免疫測定方法。ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,下面盤點(diǎn)ELISA測定操作技術(shù)要求如下:

 

1、嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

 

2、檢測前應(yīng)將試劑放置室溫平衡半小時,洗滌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,同時觀察濃縮洗滌液中有無結(jié)晶,若有結(jié)晶應(yīng)放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB時應(yīng)注意有無顏色變化,若已顯色則可能過期或變質(zhì),也不可使用。

 

3、加樣后及時放入孵育箱。標(biāo)本較多時,要分批操作。按照說明書步驟嚴(yán)格控制操作時間,防止孵育時間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗*。

 

4、封板溫育時,各孔一定要封嚴(yán),防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā),不會引起孔間的污染,產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板“的出現(xiàn)。

 

5、應(yīng)保證酶標(biāo)版清潔,整個操作過程中保證酶標(biāo)版不接觸次氯酸。

 

6、加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)版表面輕拭吸干。

 

7、合理安排檢測量,以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。

 

8、手動洗板時,加洗液要快速,沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應(yīng)新鮮配制,以免被其他試劑污染,或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板,選用無粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板,使孔內(nèi)沒有可見液體掛壁;但也不能太重,不能讓樣品干太久。酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液。

 

9、用洗板機(jī)洗板時,保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完版后在吸水紙(選擇干凈,無塵的吸水材料)上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結(jié)晶,將堵塞洗板機(jī)針孔,造成全堵或半堵狀態(tài),以致使未結(jié)合的酶標(biāo)記物不能*洗脫,而使最后底物顯色時加深,造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿后應(yīng)及時清空,以防止廢液回流對管道的污染,而使洗滌不*,造成花板。洗板結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水*清洗管道,以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數(shù)及加液量不可*按照試劑說明書設(shè)定,應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況來設(shè)定,開展新項(xiàng)目前,應(yīng)做好驗(yàn)證工作,根據(jù)洗滌的效果來決定洗滌的次數(shù)和加液量。同時應(yīng)根據(jù)儀器維護(hù)保養(yǎng)程序,定期對洗板機(jī)進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。

 

10、加樣量的準(zhǔn)確與否,直接影響抗原抗體結(jié)合物的濃度,直至最后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深,若插入太深,吸嘴外壁可能粘連太多血清,輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中,造成交叉污染。加樣時應(yīng)盡可能的垂直加樣,并加在包被孔的底部,不可加在孔的上部。標(biāo)本量大時,可考慮使用排槍加試劑,可提高速度,但使用排槍時應(yīng)注意吸嘴一定要裝好,不可松動,否則會影響加樣量的準(zhǔn)確度。加樣時保持顯色劑不外流,顯色劑應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

 

11、加樣時間間隔對結(jié)果也有一定的影響,在競爭抑制法試驗(yàn)中,理論上應(yīng)該是標(biāo)本與酶標(biāo)抗體混合后同時加入反應(yīng)孔,若標(biāo)本先于酶標(biāo)抗體加入反應(yīng)孔,則標(biāo)本會先與包被抗體進(jìn)行反應(yīng),造成特異性假陽性。若是有干擾物質(zhì)存在時表現(xiàn)明顯,在公平條件下,干擾物質(zhì)與包被抗體的結(jié)合能力會低于標(biāo)本,而在非公平條件下,干擾物質(zhì)會優(yōu)先與包被抗體進(jìn)行結(jié)合,出現(xiàn)假陽性。做HBcAb項(xiàng)目時,若標(biāo)本與酶加樣時間間隔太長,會引起吸光度的趨勢性變化,會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標(biāo)本,出現(xiàn)假陽性。

 

12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時,應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的超純水或雙蒸水,電導(dǎo)率小于1.5μS/cm,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其溶解后配制。配制后要測定其pH值,使其范圍在7.2-7.4之間。

 

 

 

 

 

 


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